Hidrofobiskā kolonnu hromatogrāfija
2.Hromatogrāfiskā kolonna (rotācijas tips)
3.Cromatogrāfiskā kolonna (manuāla)
*** Cenu saraksts visam iepriekš minētajam, uzziniet mūs, lai iegūtu
Apraksts
Tehniskie parametri
Hidrofobiska mijiedarbības hromatogrāfija(HIC) ir spēcīgs paņēmiens, ko galvenokārt izmanto olbaltumvielu atdalīšanā un attīrīšanā, it īpaši to, kam piemīt hidrofobiskas īpašības. Šī hromatogrāfiskā metode izmanto diferenciālo hidrofobisko mijiedarbību starp parauga molekulām un stacionāro fāzi, ļaujot atdalīt komponentus, pamatojoties uz to migrācijas ātrumu eluēšanas laikā ar mobilo fāzi. Šajā visaptverošajā rakstā mēs iedziļināsimies principos, darbībā, lietojumos, priekšrocībās, trūkumos un jaunākajos hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfijas sasniegumos.
Parametrs
Hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfijas principi
HIC pamats slēpjas hidrofobās mijiedarbībā starp olbaltumvielu molekulām un hidrofobiskajiem ligandiem, kas piestiprināti stacionārajai fāzei. Olbaltumvielas, kas pēc būtības ir amfātiski, satur gan hidrofīlus, gan hidrofobus atlikumus. Ūdens šķīdumos hidrofīlās atlikumi mēdz saskarties uz āru, mijiedarbojoties ar ūdens molekulām, savukārt hidrofobās atliekas bieži tiek apraktas olbaltumvielu terciārajā struktūrā. Tomēr noteiktos apstākļos, piemēram, augstas sāls koncentrācijas klātbūtnē, šīs hidrofobās atliekas var tikt pakļautas, veicinot to mijiedarbību ar hromatogrāfijas matricas hidrofobiskajiem ligandiem.
HIC mobilā fāze parasti sastāv no buferēta fizioloģiskā šķīduma ar pH diapazonu 6-8. Hidrofobās mijiedarbības uzlabošanai izmanto augstu sāls koncentrāciju, veicinot olbaltumvielu saistīšanos ar stacionāro fāzi. Pakāpeniska sāls koncentrācijas samazināšana mobilajā fāzē eluācijas laikā palielina mazgāšanas jaudu, ļaujot olbaltumvielām eluēt, pamatojoties uz to hidrofobitāti. Vispirms eluē olbaltumvielas ar vājāku hidrofobisko mijiedarbību, kam seko tie, kuriem ir spēcīgāka mijiedarbība.
Hromatogrāfijas matrica un mobilā fāze
|
|
Hromatogrāfijas matricas izvēle ir būtiska HIC, jo tā tieši ietekmē eluēto olbaltumvielu atdalīšanas efektivitāti un tīrību. Matricas ir veidotas ar vājiem hidrofobiem ligandiem, lai izvairītos no olbaltumvielu denaturācijas un neatgriezeniskas adsorbcijas, kas bieži novērota apgrieztā fāzes hromatogrāfijā. Parastās matricas ietver agarozi, poliakrilamīdu un silīcija dioksīda bāzes gēlus, kas modificēti ar hidrofobām grupām, piemēram, fenila, butila vai propila ligandiem. Mobilās fāzes sastāvam ir galvenā loma HIC. Hidrofobiskās mijiedarbības veicināšanai tiek izmantota augsta sāls koncentrācija, piemēram, amonija sulfāts ((NH4) 2SO4) vai nātrija hlorīds (NaCl). Bufera pH ir rūpīgi pielāgots, lai saglabātu olbaltumvielu stabilitāti un optimizētu saistīšanos ar stacionāro fāzi. Atdalīšanas procesu ietekmē arī bufera koncentrācija, kas parasti svārstās no 0. 0 1 līdz 0,05 mol/L. |
HIC darbības procedūra
|
HIC darbības procedūra ietver vairākus galvenos soļus, ieskaitot hromatogrāfijas kolonnas paraugu sagatavošanu, slodzi, eluēšanu un atjaunošanos. ◆ Parauga sagatavošana: Pirms iekraušanas paraugus parasti pielāgo, lai tie atbilstu sāls koncentrācijai un mobilās fāzes A (līdzsvara buferšķīduma) pH. Tas nodrošina optimālus saistīšanās apstākļus un samazina parauga atšķaidīšanu. ◆ Iekraušana: Paraugs tiek pielietots kolonnā, kur olbaltumvielas mijiedarbojas ar stacionāro fāzi, pamatojoties uz to hidrofobitāti. ◆ eluēšana: Eluāciju panāk, pakāpeniski samazinot sāls koncentrāciju mobilajā fāzē, kas vājina hidrofobisko mijiedarbību un ļauj olbaltumvielām eluēt, lai palielinātu hidrofobitāti. ◆ Reģenerācija: Pēc lietošanas kolonnu atjauno, mazgājot ar destilētu ūdeni vai atbilstošiem tīrīšanas līdzekļiem, lai noņemtu cieši saistītus piesārņotājus un sagatavotu kolonnu turpmākajiem braucieniem. |
|
Hidrofobās kolonnas hromatogrāfijas metodika
Hidrofobās kolonnas hromatogrāfijas metodika ietver vairākas būtiskas darbības, ieskaitot parauga sagatavošanu, kolonnu līdzsvarošanu, parauga slodzi, eluēšanu un frakciju savākšanu.
◆ Parauga sagatavošana:
Pirms parauga ielādes kolonnā ir svarīgi sagatavot paraugu, pievienojot pietiekamu sāli, lai tas atbilstu mobilās fāzes A sāls koncentrācijai (līdzsvara buferšķīdums). Parauga šķīduma pH arī jāpielāgo, lai tas atbilstu adsorbcijas apstākļiem.
◆ Kolonnas līdzsvarošana:
Kolonna ir līdzsvarota ar mobilo fāzi A, kas ir buferēts sāls šķīdums ar specifisku pH un sāls koncentrāciju. Tas nodrošina, ka stacionārā fāze ir piesātināta ar buferšķīdumu, kas ir gatava mijiedarbībai ar parauga olbaltumvielām.
◆ Parauga ielāde:
Sagatavoto paraugu ielādē kolonnā. Parauga tilpumu ietekmē komponentu koncentrācija un barotnes saistīšanās spēja. Atšķaidītiem paraugiem ir iespējama tieša slodze bez iepriekšējas koncentrācijas.
◆ eluēšana:
ELUUT panāk, pakāpeniski samazinot mobilās fāzes sāls koncentrāciju, tādējādi vājinot hidrofobisko mijiedarbību starp olbaltumvielām un stacionāro fāzi. Alternatīvi eluāciju var panākt, pievienojot mobilajai fāzei organiskos šķīdinātājus vai mazgāšanas līdzekļus, lai mainītu tā polaritāti vai izspiestu saistītos olbaltumvielas.
◆ Frakciju kolekcija:
Elutētās frakcijas tiek savāktas un analizētas, lai novērtētu mērķa olbaltumvielu tīrību un atjaunošanos.
Faktori, kas ietekmē atdalīšanu
Vairāki faktori būtiski ietekmē olbaltumvielu atdalīšanas efektivitāti un tīrību hidrofobās kolonnas hromatogrāfijā:
◆ Sāls koncentrācija un tips:
Sāls tipam un koncentrācijai mobilajā fāzē ir galvenā loma hidrofobās mijiedarbības modulēšanā. Parasti tiek izmantoti tādi sāļi kā amonija sulfāts un nātrija hlorīds ar koncentrāciju, sākot no 0. 75 līdz 2 mol/L amonija sulfāta un no 1 līdz 4 mol/L nātrija hlorīdam.
◆ PH:
Mobilās fāzes pH ietekmē olbaltumvielu lādiņa stāvokli un hidrofobitāti. PH attālumā no olbaltumvielu izoelektriskā punkta ir tendence atbalstīt eluāciju, samazinot hidrofobisko mijiedarbību.
◆ Temperatūra:
Kolonnas temperatūras paaugstināšana var uzlabot hidrofobu mijiedarbību, kā rezultātā uzlabojas atdalīšanas efektivitāte.
◆ Plūsmas ātrums:
Plūsmas ātrums ietekmē olbaltumvielu uzturēšanās laiku kolonnā, ietekmējot to mijiedarbību ar stacionāro fāzi.
◆ Kolonnas raksturlielumi:
Atdalīšanas efektivitāte veicina kolonnas garumu, diametru un iesaiņošanas materiālu. Kritiska ir arī stacionārā fāzes materiāla un tā virsmas īpašību izvēle.
Hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfijas pielietojums
HIC atklāj plašu pielietojumu dažādu olbaltumvielu, ieskaitot seruma olbaltumvielu, membrānās saistītos proteīnus, kodolproteīnus, receptorus un rekombinantos proteīnus. Tā maigie atdalīšanas apstākļi padara to īpaši piemērotu aktīvo vielu, piemēram, fermentu, antivielu un citu terapeitisko olbaltumvielu, attīrīšanai.
|
|
◆ Olbaltumvielu attīrīšana: HIC bieži izmanto kā pulēšanas soli, ievērojot citas hromatogrāfijas metodes, piemēram, jonu apmaiņas hromatogrāfiju vai afinitātes hromatogrāfiju, lai sasniegtu augstu tīrības līmeni. ◆ antivielu attīrīšana: Monoklonālas antivielas un citus imūnglobulīnus var efektīvi attīrīt, izmantojot HIC, atvieglojot to izmantošanu terapeitiskā un diagnostiskā lietojumā. ◆ Olbaltumvielu variantu atdalīšana: HIC var atšķirt olbaltumvielu izoformas, aktīvās un neaktīvās formas un saīsinātās sugas, palīdzot biofarmaceitisko līdzekļu raksturošanai un kvalitātes kontrolei. |
HIC priekšrocības un trūkumi
Priekšrocības:
1) Augsts atveseļošanās līmenis: HIC piedāvā augstu olbaltumvielu reģenerācijas ātrumu, padarot to efektīvu liela mēroga attīrīšanas procesiem.
2) saglabāta olbaltumvielu aktivitāte: vieglie atdalīšanas apstākļi samazina olbaltumvielu denaturāciju un aktivitātes zudumu.
3) Daudzpusība: HIC var pielāgot plaša diapazona olbaltumvielu attīrīšanai ar atšķirīgām hidrofobām īpašībām.
Trūkumi:
1) Ierobežota šķīdība: Dažām olbaltumvielām var būt samazināta šķīdība ar lielu sāls koncentrāciju, ierobežojot to pielietojamību HIC.
2) Sāls traucējumi: augsta sāls koncentrācija mobilajā fāzē var traucēt turpmākajiem analītiskajiem posmiem, kas prasa papildu atsāļošanas procedūras.
Jaunākie sasniegumi un turpmāki virzieni
Jaunākie sasniegumi HIC ir vērsti uz jaunu hromatogrāfijas matricu attīstību ar pastiprinātu atdalīšanas efektivitāti un stabilitāti. Hidrofilās mijiedarbības hromatogrāfijas (HILIC) principu iekļaušana un jaukta režīma sveķu izmantošana ir paplašinājusi HIC pielietojamību polāro savienojumu atdalīšanai.
Turklāt HIC integrācija ar citām hromatogrāfijas metodēm, piemēram, jonu apmaiņas hromatogrāfiju vai lieluma izslēgšanas hromatogrāfiju, ir veicinājusi efektīvāku un stabilāku attīrīšanas protokolu izstrādi. Automatizācijas un augstas caurlaides skrīninga tehnoloģiju sasniegumi ir veicinājuši arī HIC procesu mērogojamību un reproducējamību.
Turpmākie virzieni HIC pētījumos ietver alternatīvu ligandu un matricu izpēti, lai vēl vairāk uzlabotu atdalīšanas efektivitāti un paplašinātu lietojumprogrammu apjomu. Videi draudzīgāku un ilgtspējīgāku mobilo fāžu attīstība, kā arī eluācijas apstākļu optimizācija, lai samazinātu olbaltumvielu denaturāciju, joprojām pastāv notiekošo pētījumu jomas.
Noslēgumā jāsaka, ka hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfija ir daudzpusīgs un efektīvs līdzeklis olbaltumvielu atdalīšanai un attīrīšanai, īpaši tiem, kuriem ir hidrofobiskas īpašības. Izmantojot diferenciālo hidrofobisko mijiedarbību starp parauga molekulām un stacionāro fāzi, HIC ļauj attīrīt augstas kvalitātes olbaltumvielas dažādiem terapeitiskiem, diagnostiskiem un pētniecības pielietojumiem. Ar pastāvīgiem sasniegumiem hromatogrāfijas materiālos, automatizācijā un integrācijā ar citām metodēm HIC nākotne sola vēl lielāku efektivitāti un plašāku pielietojamību biofarmaceitisko līdzekļu jomā.
Populāri tagi: Hidrofobās kolonnas hromatogrāfija, Ķīnas hidrofobās kolonnu hromatogrāfijas ražotāji, piegādātāji, rūpnīca
Nosūtīt pieprasījumu
